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原理如下:激光聚焦成线度接近单个分子的极小斑点,照射样品,使之产生荧光,但只有焦点处的荧光可以被探测到,离开焦点的荧光将受到紧靠探测器的空间滤波器的阻碍,不会进入探测器,可以得到样品细胞一个层面的图像。连续改变激光的焦点,可在一系列层面进行扫描,得到整个样品细胞的三维图像。目前,利用多光子技术,用近红外光激发可以减小单光子激光扫描共焦显微镜对细胞的损伤,可以观察到样品更深层的荧光成像,具有更高的分辨率。是目前的发展方向。